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PCR-Diagnostik

Im IML werden seit Mitte November 2022 zwei verschiedene PCR-Untersuchungen zum Nachweis von SARS-CoV-2 verwendet:

Für die Diagnostik bei Patienten mit der Symptomatik einer respiratorischen Infektion kommt eine Multiplex-PCR zum Einsatz, die neben SARS-CoV-2 noch weitere respiratorische Viren detektiert. Der Nachweis von SARS-CoV-2 erfolgt hier über die Detektion von drei SARS-CoV-2 spezifischen Genen, dem RdRP-Gen sowie dem N-Gen und dem S-Gen, wobei letztere beiden Gene kumulativ in einem einzelnen Detektionskanal nachgewiesen werden. SARS-CoV-2 gilt als nachgewiesen sobald mindestens eines der Ziel-Gene detektiert wurde.

Für das Screening von Patienten, als Bestätigungstest bei konkretem Verdacht auf eine Infektion mit SARS-CoV-2 oder für Verlaufskontrollen bei bekannten Infektionen kommt eine Einzel-PCR zum Einsatz. Der Nachweis von SARS-CoV-2 erfolgt hier ebenfalls über die Detektion von drei SARS-CoV-2 spezifischen Genen, dem RdRP-Gen, dem N-Gen und dem E-Gen, wobei alle drei Gene einzeln in einem separaten Detektionskanal nachgewiesen werden. Auch hier gilt SARS-CoV-2 als nachgewiesen sobald mindestens eines der Ziel-Gene detektiert wurde.

 

Interpretation des Ct-Wertes

Der Ct-Wert (Cycle-Threshold) gibt an, nach wie vielen Zyklen der Amplifikation durch die PCR ein positives Signal erreicht wurde.  Damit ist der Ct-Wert von der Menge der eingesetzten Nukleinsäure abhängig und kann ein Maß für die zu Beginn der Reaktion vorhandene Konzentration des Zielgens darstellen. Niedrige Ct-Werte bedeuten hohe Viruskonzentration, hohe Ct-Werte niedrige Konzentration.

Für Zellkulturen wird derzeit eine Viruslast von 1E6 (1.000.000) im Untersuchungsmaterial als minimale Infektionsdosis angesehen. Der angegebene Ct-Grenzwert wird durch Mitführen eines Standards ständig überprüft und kann in verschiedenen Testsystemen unterschiedlich ausfallen.

Zu beachten ist, dass diese Interpretation des Ct-Wertes ausschließlich im Rahmen der durch das RKI vorgegebenen Empfehlungen zur Entisolierung von Patienten Gültigkeit hat, deren Symptombeginn mindestens 10 Tage zurückliegt und die außerdem seit mindestens 48 h deutliche Besserung der klinischen Symptomatik aufweisen. S. dazu auch die Hinweise des RKI zum Entlassmanagement: https://www.rki.de/DE/Content/InfAZ/N/Neuartiges_Coronavirus/Entlassmanagement.html

Darüber hinaus ist bei der Interpretation der Viruslast in der Probe jedoch zu bedenken, dass der Wert keinen unmittelbaren Rückschluss auf die Viruslast am Entnahmeort erlaubt, weil eine hohe Variabilität in der Qualität der Proben besteht. Dies gilt insbesondere für Abstriche, bei denen die Menge des enthaltenen Materials sehr von der Abstreichtechnik abhängt. Weiterhin sind niedrige Viruskonzentrationen zu Beginn der Infektion, also auch vor Beginn der Symptome, zu erwarten, werden aber ebenfalls im Verlauf nach Abklingen der Symptome gesehen. Eine niedrige Konzentration kann also auf eine frühe oder eine späte Phase der Infektion hinweisen und stellt ohne weitere Information keinen Prädiktor für die an den darauffolgenden Tagen zu erwartende Konzentration dar. Es ist zudem zu berücksichtigen, dass nicht bekannt ist, ab welcher Viruslast ein Patient als infektiös einzustufen ist.

Da in unserem Labor zwei unterschiedliche PCR-Systeme für den Nachweis von SARS-CoV-2 zum Einsatz kommen, gelten für die Interpretation des Ct-Wertes zwei verschiedene Umrechnungstabellen (jeweils hervorgehoben der Cut-off für die Viruslast von 1.000.000 Kopien/ml Proben-Eluat):

Multiplex-PCR respiratorische Viren

Ct-Wert

Viruskopien/ml Proben-Eluat

≤ 22

> 10.000.000

23

10.000.000

24

6.600.000

25

3.300.000

26

1.000.000

27

660.000

28

330.000

29

100.000

30

66.000

31

33.000

32

10.000

33

6.600

34

3.300

35

1000

Einzel-PCR SARS-CoV-2

Ct-Wert

Viruskopien/ml Proben-Eluat

≤ 18

> 10.000.000

19

10.000.000

20

6.600.000

21

3.300.000

22

1.000.000

23

660.000

24

330.000

25

100.000

26

66.000

27

33.000

28

10.000

29

6.600

30

3.300

31

1000